NSCLC索拉菲尼的耐药机制

J Pharmacol Exp Ther. 2017 Oct 11. pii: jpet.117.240507. doi: 10.1124/jpet.117.240507. [Epub ahead of print]
Activation of FAK and Src mediates acquired sorafenib resistance in A549 human lung adenocarcinoma xenografts.
标题：肺腺癌A549细胞FAK（黏附斑激酶）和Src介导索拉菲尼耐药
（ASCO2014：FAK 抑制剂Defactinib治疗 KRAS 突变型 NSCLC 的 II 期临床，clinictrails.Com  NCT01951690）
摘要：
尽管KRAS突变非小细胞肺癌(NSCLC)患者，对索拉菲尼单药治疗的临床疗效令人鼓舞，但这种药物的总体生存效益受限于不可避免的获得性耐药性。目前尚不清楚，在KRAS突变的NSCLC中获得KRAS的确切机制是什么。在本研究中，利用一种生物相关的异种移植模型，利用A549人的肺腺癌细胞系和一种体内衍生的索拉菲尼耐药A549 子系(A549/srfres)，探索索拉菲尼获得性耐药机制。初步研究结果表明，索拉菲尼的治疗明显降低了上皮细胞钙黏蛋白E-cadherin(P<0.05)水平，但在A549/SRFres肿瘤中明显增加了基质金属蛋白酶MMP9水平(P<0.01)，而在索拉菲尼治疗的A549和A549/srfres肿瘤中，磷酸化AKT，FAK，Src的表达水平升高。我们接下来研究的是，如果伴随的达沙替尼治疗可以通过阻断治疗耐药FAK /src逃逸路径来克服获得的索拉非尼的耐药。尽管在体外观察到索拉非尼和达沙替尼之间的协同作用，但体内半剂量索拉非尼和达沙替尼联合治疗的抗肿瘤效果不如全剂量索拉非尼治疗的效果。虽然索拉菲尼+达沙替尼联合有效抑制了Src和AKT的磷酸化，但它并没有阻止y576-577- FAK磷酸化，也没有减少波形蛋白表达，而是出乎意料地增加了y397- FAK磷酸化和MMP9蛋白表达。这些结果表明，在KRAS突变的A549型异种移植中获得索拉非尼的耐药，涉及到FAK和Src的补偿激活，而Src抑制本身不足以削弱索拉非尼促进的上皮间间质间过渡(EMT)过程和肿瘤的侵犯潜能。
引言：
在过去的二十年里，分子靶向治疗的快速发展已经彻底改变了晚期癌症的治疗前景。随着靶向治疗药物的使用越来越多，应对不可避免的获得性药物耐药的发展面临着挑战。在非小细胞肺癌靶向治疗领域,大部分努力都集中开发表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂作为患者的一线治疗EGFR突变(Pao和Chmielecki,2010),和识别获得性EGFR抑制剂耐药机制, 这样可以开发治疗方法克服耐药(Wheeler et al., 2010)。除了EGFR突变外，激活KRAS突变，异常激活RAS/RAF/MEK/ERK 通路也经常发生在NSCLC中，主要是腺癌(Gotz，2008年)。据报道，KRAS突变的NSCLC患者突变约为15% (Chan and Hughes, 2015) 。由于对KRAS的直接抑制仍在治疗上具有挑战性，因此治疗KRAS突变的NSCLC的另一种方法是靶向RAS下游的信号通路。在这方面，最近进行了几项临床试验，研究了索拉菲尼的疗效，这是一种多激酶抑制剂，靶向RAF/MEK/ERK和血管内皮生长因子受体(VEGFRs)和血小板源受体生长因子受体在NSCLC的治疗中(PDGFRs)(Wilhelm等人，2006)。
在BATTLE (生物标志物方法消除肺癌的靶向治疗) 试验, 设计评估小分子激酶抑制剂治疗化疗难治NSCLC患者的有效性，基于相关的分子生物标志物(Kim et al .,2011),索拉非尼治疗导致整体高于平均水平的8周疾病控制率(DCR)(58%比46%)在 KRAS/ BRAF,VEGF / VEGFR-2和非吸烟组。更令人注目的是，索拉非尼的DCR有79%的DCR与埃罗替尼的14%DCR，在KRAS/BRAF标记组(Kim et al.,2011) 。然而，三期MISSION试验的结果是，在晚期复发或难治性NSCLC的患者中用索拉非尼单药治疗。表明索拉非尼单疗法并没有改善整体的生存率，尽管在统计上显著改善了几个次要的终点，包括无进展的生存率和疾病进展的时间(pazal-ares等，2015年)。总的来说，这些临床数据表明，索拉非尼最初的治疗是有效的，但是对药物的耐药性最终还是出现。由于获得性耐药是限制索拉非尼治疗KRAS突变NSCLC患者临床成功的一个主要因素，理解这种耐药的分子机制将会是对治疗效果的最大化至关重要。获得性索拉非尼耐药与可选的受体酪氨酸激酶激活的旁路信号的激活有关。在不同的实验条件下，已报告自适应的多样性的分子事件导致耐药,包括金属硫蛋白-1G(MT-1G)诱导(Sun et al .,2016)和并行通路的激活促进恶性肿瘤,如蛋白激酶B （AKT）通路(Chen et al .,2011;Morgillo et al., 2011;Lindblad et al., 2016), 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路 (Morgillo et al., 2011;Lindblad等人，Harada et al., 2014),信号转导和转录激活3 (STAT3)通路 (Tai et al., 2012), 肝细胞生长因子(HGF)/c-met途径(Firtina Karagonlar等人，2016)，以及胰岛素样生长因子(IGF)/纤维细胞生长因子(FGF)途径(Harada等人，2015)。在目前的研究中,我们试图研究非小细胞肺癌适应逃避索拉非尼治疗的分子机制，用索拉非尼获得性耐药的有关异种移植模型,并将索拉非尼和达沙替尼联合治疗,希望增加索拉非尼抗肿瘤疗效对索拉非尼获得性耐药肿瘤,并阐明索拉非尼和达沙替尼之间的相互作用的潜在机制。达沙替尼是一种针对多种蛋白激酶的有效激酶抑制剂，包括Bcr-Abl、Src、干细胞因子受体(c-kit)、纤维细胞生长因子受体1(FGFR-1)和PDGFR(Kantarjian等，2006)。到目前为止，还没有对索拉非尼和达沙替尼的联合治疗方法进行描述。通过使用A549人的肺腺癌模型，我们能够在肿瘤微环境的背景下探索索拉非尼获得性耐药机制，众所周知，这有助于对靶向治疗的肿瘤耐药认识(McMillin等人，2013)。这次调查的目的不仅仅是为了获得对NSCLC索拉非尼获得性耐药更广泛的理解，同时也为靶向联合治疗的合理设计提供了一个框架，可以有效地处理这种耐药。
结果：
体内选择索拉菲尼耐药A549细胞系异种移植模型
在最近的临床试验，鉴于EGFR野生和KRAS突变NSCLC患者从索拉非尼治疗获益已被证明(Blumenschein et al., 2013;Dingemans et al., 2013),人类腺癌A549细胞株表达野生型EGFR和有G12S  KRAS突变(Mahoney et al .,2009)用于建立索拉非尼在体内肿瘤耐药模型。据报道，30到60毫克的索拉非尼的治疗导致了A549异种移植的肿瘤完全停滞(Wilhelm等人，2004年)。因此，在本研究中，A549荷瘤的裸鼠被给予口服40毫克/公斤的索拉非尼。这种治疗动物耐受良好。没有发现死亡或明显的副作用。在这样的剂量水平下，观察到与平均肿瘤大小减少高达86%，具有高度统计学意义。对照组的小鼠提前到达预定的终点(肿瘤体积=1000 mm3)，因此进行研究的时间比索拉菲尼治疗的小鼠要短(对照组的小鼠为6周，而索拉菲尼治疗组的小鼠则为15周。在为期15周的治疗期间，索拉非尼治疗的小鼠表现出不同的肿瘤生长率。肿瘤体积的折变(即: 肿瘤生长指数值)在15周的治疗期后为0.9-30.2，中间值为3.6。在随后的研究中，以肿瘤生长指数为30.2的最快速生长的索拉菲尼治疗549异种移植物得到了A549/srfres的子克隆。与A549型异种移植物模型相比，在单个小白鼠的左侧接种A549细胞和同时右侧接种A549/SRFres细胞，并对其进行了进一步的评估。在接受了8周的治疗后，2只溶媒治疗的动物和两只索拉菲尼治疗的动物被处死，一只老鼠经过10周溶媒治疗后被处死，因为它们的肿瘤达到了最大允许的体积(即, 1000 mm3) 。同样，经过10周索拉菲尼治疗后一只老鼠也被处死。当肿瘤接种开始治疗一周后，所有研究小组的肿瘤体积并无显著差异。索拉非尼治疗A549和A549/SRFres肿瘤，从第9周到第12周观察到对肿瘤生长的明显抑制(P<0.05)，与相应的溶媒治疗比较。在为期12周的治疗期间，A549/srfres的肿瘤生长速度快相对于A549肿瘤。对于溶媒参照组，在第2、3、4、5、6和12周(P<0.05)，A549和A549/srfres肿瘤的肿瘤体积的差异在统计学上是有意义的。对索拉非尼治疗组来说，在第2、3、5、6,9、10和11周(P<0.05)，他们的肿瘤体积与他们的父母相对应的肿瘤体积有明显的差异。对A549/srfres异种移植的平均肿瘤生长指数值高于A549型异种移植物(13.7+/-3.9和8.7+/-5.3)，但差异在统计学上没有显著性(P=0.184)。按照索拉非尼治疗的肿瘤应答，索拉非尼有效抑制了A549和A549/srfres异种移植的生长，分别显示为A549和a54/srfres肿瘤的平均肿瘤生长指数值下降了67%(P<0.05)和56%(P<0.01)。对比索拉菲尼治疗的A549/srfres肿瘤和他们的亲代肿瘤的肿瘤生长率，在治疗开始后的第3、4和6周，发现549/srfres肿瘤的平均体积比A549肿瘤的平均体积要大得多(P<0.05)。此外，索拉非尼治疗的A549/srfres肿瘤的平均肿瘤生长指数值明显高于A549肿瘤(6.0+/- 3.9和2.9+/-1.3，P<0.05)。这些结果表明，A549/SRFres肿瘤对索拉非尼的耐药相对较强。综合来看，索拉非尼治疗的A549/SRFres肿瘤的生长速度明显快于他们的索拉菲尼治疗的父系A549，这可能部分归因于相对快速的A549/SRFres肿瘤生长。
确认索拉菲尼获得性耐药的可能机制
为了确定索拉非尼获得性耐药的分子机制，西方的墨迹分析被用来评估选择的EMT标记和蛋白激酶水平，在溶媒治疗和索拉非尼治疗的A549和A549/srfres肿瘤。对A549异种移植而言，与对照组相比，在索拉菲尼治疗肿瘤中，β-catenin表达水平明显下降(44%下降，P<0.05)。而A549/SRFres的异种移植中，β-catenin和E-cadherin的表达水平也明显下降(分别下降36%和P<0.05)，MMP9(362%增加，P<0.01)和磷酸化FAK (增加138%，P<0.05)，在索拉非尼治疗的肿瘤中，与对照组相比，其水平显著提高。另外，在A549和A549/srfres中，磷酸化Src的表达率分别增加了56%和59%，虽然还没有达到统计意义(A549和A549/srfres肿瘤分别为p=0.099和0.069)。尽管如此,鉴于Src的突出作用在受体酪氨酸激酶(RTK)介导的信号转导通过RAS /RAF/ MAPK和PI3K / AKT通路激活促进细胞生存,有丝分裂发生、迁移和侵犯(Bromann et al .,2004;Thamilselvan et al .,2007),这一发现提示我们推测FAK / Src信号通路的激活创建一个旁路促进索拉非尼耐药,使用Src抑制剂联合索拉非尼可能拮抗索拉非尼耐药因FAK-Src介导的旁路信号通路。
体外A549/SRFres细胞与父系A549细胞相比，增殖，迁移和侵犯表型没有变化
为研究体内的长期影响，在体外实验中对A549/SRFres细胞暴露于索拉菲尼打压，加倍时间测定，使用损伤治疗分析和跨壁侵犯分析指导。在A549的父母和A549/srfres细胞之间没有明显的差异(23.7 +/- 1.9 hr和24.3 +/- 1.7 hr，P > 0.05)。此外，A549/srfres细胞的迁移和侵犯表型与A549细胞的相似(P-0.05)。这些数据表明，在治疗压力下体内获得的A549/SRFres细胞的侵犯行为是可逆的。
在培养的A549/ A549/SRFres细胞检查索拉菲尼和达沙替尼治疗诱导的分子变化
为了确认fak-src信号通路的激活是否是A549异种移植肿瘤中获得的索拉非耐表型的原因，在A549的亲代和A549/srfres细胞中，比较了EMT标记的蛋白表达水平和调控细胞增殖、迁移和入侵的下游信号分子的变化。在A549/srfres细胞中，与A549的亲代细胞基线表达水平相比，磷酸化Src (Y416)和磷酸化FAK (y576/577) 明显提高了60%，分别增加60%和110%。用了10μM的索拉非尼治疗4小时，对磷酸-src和磷酸化FAK (y576/577)的表达没有任何影响。相比之下，达沙替尼治疗的0.02μM和0.2μM足以抑制磷酸化Src在Tyr-416位和磷酸化FAK在Tyr-576/577位。此外，联合索拉非尼和达沙替尼的联合治疗导致了A549/srfres细胞的Src磷酸化更大程度的下降与A549细胞相比，这表明A549/SRFres细胞具有较高的磷酸化Src水平，对索拉菲尼+达沙替尼联合治疗是相对敏感的。在A549的父母和A549/srfres细胞之间的其他蛋白质的表达水平上，没有显著的差异。
体外评估索拉菲尼-达沙替尼联合治疗的细胞毒效果在A549 父系和A549/SRFres细胞
在A549和A549/srfres细胞中，对索拉非尼和达沙替尼联合治疗的体外细胞毒性作用进行评估，用1：3、1:1和3:1的固定摩尔比例来使用索拉非尼和达沙替尼。对索拉非尼和达沙替尼治疗的剂量效应关系进行定量分析，并结合使用，结果表明，在A549细胞系中，索拉非尼和达沙替尼的IC50值与索拉菲尼耐药子克隆(即: A549/SRFres)类似, 而联合索拉非尼和达沙替尼治疗对细胞增殖的抑制作用比单独使用两种药物治疗的效果都要大。在将联合指数(CI)方法应用时，我们假设索拉非尼和达沙替尼是相互无排斥的，即索拉非尼在RAF/VEGFR/PDGFR上的作用并不影响达沙替尼在Src/ABL上的作用。对于A549 / SRFres细胞,同时连续接触索拉非尼和达沙替尼在固定的摩尔比率1:1和3:1 72 h显示协同(CI < 1)影响的分数(FA)值在0.1和0.9之间,而索拉非尼和达沙替尼的组合固定1:3的摩尔比率显示协同(CI < 1)FA值大于0.4。对A549细胞,同时暴露在索拉非尼和达沙替尼的摩尔比1:1产生添加弱协同效应FA值从0.2到0.8,索拉非尼和达沙替尼的摩尔比例1:3和3:1导致了添加协同效应为FA值大于0.4。综合来看，这些数据清楚地表明，在以1:3和3:1的摩尔浓度比例使用时，与索拉非尼和达沙替尼联合治疗对A549和A549/srfres细胞有效。
体内A549 父系和A549/SRFres异种移植模型索拉菲尼和达沙替尼单药和联合的应答
我们观察了在A549和A549/srfres细胞中对索拉非尼和达沙替尼进行联合治疗的附加和协同作用的细胞毒性效应，我们下一步评估在已建立的A549和A549/srfres肺癌异种移植中单独和联合治疗的抗肿瘤效果。当治疗在肿瘤接种三周后开始时，所有研究小组观察到的肿瘤体积均无显著差异。索拉非尼和达沙替尼治疗的剂量水平为20毫克/公斤/每天，显著抑制了A549/srfres的生长，其最大肿瘤生长抑制率分别为45% (P<0.01)和35% (P<0.05)，但不能显著抑制A549肿瘤的生长。在A549型异种移植中，索拉菲尼肿瘤生长抑制的效果在治疗开始后的1.5周内显著增加，最大肿瘤生长抑制率为72%(与对照组相比，P < 0.01)。在索拉非尼-达沙替尼联合治疗后的3.5周内，肿瘤生长抑制才显著，而最大的肿瘤生长抑制率为53% (P<0.05)。用40毫克/公斤/每天达沙替尼治疗只能达到30%的最大肿瘤生长抑制率(P > 0.05)。在A549/SRFres异种移植中，索拉非尼和索拉非尼的联合抑制作用在肿瘤生长的一个星期后明显增加，肿瘤生长抑制率分别为75%和69%( P < 0.01，两者均与对照组相比)。相比之下，尽管达沙替尼单一疗法能够产生最大的肿瘤生长抑制率为52%(P>0.05，与对照组相比)。达沙替尼对肿瘤生长的抑制作用在统计学上没有统计学意义，除了第3周(P<0.05)。与父系细胞对比，溶媒和索拉菲尼治疗的A549/SRFres肿瘤的肿瘤生长率显著提高(P<0.05)或P < 0.01，使用双样本T测试）。然而，达沙替尼治疗和联合治疗肿瘤生长率与相应的亲代细胞肿瘤的肿瘤生长率并没有显著的差异(P > 0.05)。总的来说，在A549和A549/srfres异种移植中，单独使用索拉非尼治疗，在40毫克/公斤/每天的情况下，产生了最显著的肿瘤生长抑制，这远远超过了达沙替尼40毫克/公斤的治疗所取得的效果。半剂量的索拉非尼-达沙替尼联合比20毫克/千克/每天达沙替尼治疗在A549 (P<0.05)和A549/SRFres P < 0.01的异种移植中更有效，也比A549/SRFres异体移植(P<0.05)的20mg/kg/d索拉菲尼治疗更有效。在40毫克/公斤的索拉非尼治疗和半剂量索拉非尼-达沙替尼联合组中发现平均肿瘤体积没有显著的差异，在A549或a54/srfres异种移植物(P>0.05)。此外，在溶媒和索拉非尼治疗的A549/SRFres肿瘤中观察到显著的快速肿瘤生长，而不是在达沙替尼和联合治疗的A549/SRFres肿瘤，与它们的相应的父母相比较。
A549 父系和A549/SRFres异种移植模型索拉菲尼和达沙替尼单药和联合对肿瘤血管生成、增殖和粘附的影响
培养的A549和A549/SRFres细胞的免疫荧光染色结果显示，在这两种细胞系之间的基线Ki67、E-cadherin、α-SMA和胶原蛋白4的表达水平没有差异。尽管如此，在A549和A549/srfres异种移植物模型中，使用全剂量索拉非尼和半剂量索拉非尼-达沙替尼联合治疗后，观察到肿瘤生长抑制，进一步评估了单药和联合治疗的体内抗肿瘤活性的机制。增殖是肿瘤进展的一个关键特征，通常通过对核抗原Ki67的免疫组织化学评估来估计。从这个研究结果表明，在A549和A549 / SRFres异种移植模型，与参照肿瘤相比，Ki67增殖指数值减少意味着有统计学意义(P < 0.05全剂量索拉非尼和半剂量的联合)，虽然全剂量索拉非尼和半剂量的达沙替尼联合治疗只有A549 / SRFres肿瘤明显的减少。尽管如此，在索拉菲尼治疗的A549/SRFres肿瘤中，Ki67增殖指数值明显增加，与它们的亲代相比(下降了38%，P<0.05)，这表明在A549/SRFres肿瘤中减少了索拉非尼的抗增殖活性。此外, Ki67增殖指数值与4周后A549和A549 / SRFres肿瘤体积高度相关(皮尔森:r = 0.544 A549,r = 0.542 A549 / SRFres,N = 28,P < 0.01),表明抑制索拉非尼和达沙替尼对肿瘤生长的影响是归因于单个药物的抗增殖活性。此外，ki-67免疫荧光染色的结果与肿瘤部分的h&e染色结果相一致，显示出相对性。与对照肿瘤相比，在接受药物治疗的肿瘤中出现了大面积坏死。
E-cadherin在维持上皮组织细胞与细胞粘附方面起着至关重要的作用。下调E-cadherin与肿瘤的进展、侵袭和转移有关(Rodriguez et al., 2012)。肿瘤部分的免疫荧光染色结果显示E-cadherin表达水平明显降低在索拉非尼治疗的A549肿瘤(减少30%，P <0.05)，但不是索拉菲尼治疗A549/SRFres肿瘤(减少8%，P>0.05) 与参照组相比。采用免疫组织化学标记对内皮细胞(与CD31)、微血管基底膜(与胶原蛋白4)和壁细胞，即周细胞和平滑肌细胞(与α-SMA)的免疫组织化学标记评估单药和联合治疗对肿瘤血管系统的影响。作为一种有效的抗血管药物,索拉非尼能够减少微血管密度(MVD)由CD31阳性染色确定在A549(P < 0.01)和A549 / SRFres(P < 0.05)异种移植,而足量达沙替尼治疗导致了MVD明显降低A549异种移植(P < 0.05),但不是在A549 / SRFres异种移植。值得注意的是，在达沙替尼治疗的A549/SRFres肿瘤的平均MVD明显高于其亲代(P <0.05)，这表明达沙替尼对肿瘤的肿瘤血管生成没有任何影响。在半剂量索拉非尼-达沙替尼联合治疗中出现的MVD明显减少，在A549/SRFres肿瘤(P <0.05)，而不是A549个肿瘤。至于胶原蛋白4，全剂量索拉非尼的治疗明显减少了A549肿瘤的胶原蛋白4表达水平，而不是549/srfres肿瘤，与溶媒治疗和半剂量索拉非尼-达沙替尼联合相比(P <0.05)。全剂量达沙替尼治疗在A549/SRFres肿瘤明显增加了胶原蛋白4表达与父系细胞相比(P <0.05)，这与它在A549/SRFres肿瘤中减少对MVD的作用相一致。与全剂量的达沙替尼治疗相比，半剂量联合治疗可以有效地降低A549/SRFres肿瘤的胶原蛋白4表达水平(P <0.05)。至于α-SMA，在研究小组中没有发现统计学上的显著差异，这表明没有一种治疗方法会影响到壁细胞。总之，肿瘤组织免疫荧光染色的结果证实，索拉非尼和达沙替尼的抗肿瘤效果可归因于它们的抗增殖和抗血管生成特性，而A549/srfres肿瘤的细胞增殖率比A549肿瘤要高。
A549 父系和A549/SRFres异种移植模型索拉菲尼和达沙替尼单药和联合抗瘤效果的内在机制
除了组织学分析外，还进行了西方印迹分析，以阐明索拉非尼和达沙替尼单独和联合介导的肿瘤生长抑制的内在分子机制，并确认在治疗过程中发展的任何可能的逃逸路径。在A549型异种移植模型，与对照肿瘤相比，40毫克/公斤/每天的索拉非尼治疗明显降低了MCL-1 (达38%，P < 0.01)和磷酸化-GSK3(55%，P < 0.01) 的表达，但是增加了磷酸化-akt的表达(30%，P <0.05)。另一方面，40毫克/公斤/每天的达沙替尼治疗，明显降低了磷酸化-src (50%，P小于0.05)和磷酸化-ERK (19%，P <0.05) 的表达，但是增加了y397- FAK磷酸化(191%，P <0.05)。半剂量的索拉非尼-达沙替尼联合导致了磷酸化ERK的表达明显减少(21%，P <0.05)，并且明显增加了y397- FAK磷酸化(119%，P <0.05)。另外，在接受治疗的A549型肿瘤中，40 mg/kg/d达沙替尼治疗磷酸化src的表达比索拉菲尼治疗的A549肿瘤低58%( P <0.05)，而在使用半剂量联合治疗的A549型肿瘤中，磷酸化-akt表达比索拉菲尼治疗的A549肿瘤低26% (P <0.05)。在类似的情况下，20毫克/kg/d索拉非尼的治疗显著地降低了GSK3的磷酸化 (P <0.05)，而20毫克/公斤/每天的达沙替尼治疗结果显著减少了Y416-src磷酸化和y57/577- FAK磷酸化(P <0.05和P < 0.01，分别与20 mg/kg/d索拉菲尼与溶媒组相比)。在A549/SRFres肿瘤中，与对照肿瘤相比，40 mg/kg/d索拉菲尼明显减少了MCL-1和磷酸化-gsk3的表达，分别降低了16%和53%( P <0.05)，但增加了114%磷酸化-src表达 ( P <0.05)。达沙替尼在40 mg/kg/d的治疗中明显降低了磷酸化GSK3和磷酸化MEK的表达，分别减少了38%( P <0.05)和21%( P < 0.01)，但与对照组相比，提高了y397- FAK的磷酸化率，增加了177%( P <0.05)。此外，半剂量联合治疗明显降低了MCL-1和磷酸化GSK3的表达，分别减少了17%和38%( P <0.05)，而与对照组相比，y397- FAK磷酸化增加192%( P < 0.01)。此外，在40 mg/kg/d的索拉非尼治疗A549/SRFres中，磷酸化src的表达明显增加，与40 mg/kg/d达沙替尼单药治疗相比(95%，P < 0.01)，及与索拉非尼和达沙替尼联合(71%，P <0.05)相比，这表明达沙替尼有效抑制了肿瘤中的Src活性。此外，半剂量联合组中磷酸化AKT表达水平低于全剂量达沙替尼组(17%，P <0.05)。类似地，20 mg/kg/d索拉非尼和达沙替尼单药治疗大大降低了磷酸化GSK3的表达(P <0.05)。在20 mg/kg/d达沙替尼治疗肿瘤中，磷酸化src(P <0.05)、磷酸化AKT(P <0.05)和磷酸化- p90RSK (P < 0.01)的表达明显降低，与20 mg/kg/d索拉非尼治疗肿瘤相比。A549和A549/SRFres配对样本T检验结果显示，在索拉菲尼和索拉非尼-达沙替尼联合治疗A549/SRFres肿瘤中，磷酸化ERK和磷酸化GSK3水平明显降低，这表明ERK和GSK3不太可能出现在索拉非尼的耐药旁路机制中。总的来说，尽管达沙替尼单独或与索拉非尼联合，在A549和A549/srf肿瘤中明显降低了磷酸化src的水平，但与索拉非尼治疗的肿瘤相比，在所有治疗组中，磷酸化FAK (Y397)的水平仍然较高，无论肿瘤类型如何。在其他的下游效应器中，涉及索拉非尼的抗肿瘤效应，包括MCL-1、磷酸化AKT、磷酸化ERK、磷酸化p90RSK、磷酸化GSK-3 (Liu et al., 2006; Ulivi et al., 2009)。半剂量索拉非尼-达沙替尼联合在这些蛋白的表达水平上的抑制作用可与全剂量索拉非尼或达沙替尼治疗相媲美，而不考虑肿瘤类型。
几条细胞系证据表明，索拉非尼的耐药与激活的EMT过程和增加肿瘤转移有关(Wang et al.,2014)。因此，在A549和A549/srfres异体移植模型中，我们研究了单剂和联合治疗对EMT生物标记物和肿瘤转移潜力选择标记物的影响，包括E-cadherin，β-catenin和vimentin，以及MMP9和α-SMA。A549和A549 / SRFres肿瘤,全剂量索拉非尼治疗导致上皮细胞标记E-cadherin钙粘蛋白的表达明显下降(44%,P < 0.01,A549对A549 / SRFres 38%,P < 0.05),并显著增加间充质细胞标记物的表达vimentin波形蛋白表达(25%,P < 0.05 A549；45%,P < 0.05 A549 / SRFres)与参照组相比。同时，在A549和A549/srfres的肿瘤中，使用半剂量索拉非尼-达沙替尼联合治疗肿瘤的vimentin表达明显增加分别为(20%)和(39%)，与对照肿瘤相比(两者均为P <0.05）。全剂量达沙替尼治疗导致明显增加在A549细胞 (268%)和A549 / SRFres肿瘤(177%) MMP9的表达，与溶媒参照组相比(P < 0.01),而在半剂量索拉菲尼-达沙替尼联合治疗A549 / SRFres 细胞MMP9的表达水平明显提高 (233%,P < 0.05与参照相比)。索拉非尼治疗剂量为20毫克/公斤，在A549肿瘤(P <0.05)中明显减少β-catenin表达，而20毫克/公斤的索拉非尼和达沙替尼单药治疗增加了A549/SRFres肿瘤中vimentin的表达(P <0.05)。另外，在全剂量达沙替尼治疗的A549肿瘤中，E-cadherin和α-SMA的表达水平明显高于全剂量索拉非尼治疗的A549肿瘤(P <0.05的E-cadherin和P < 0.01α-SMA)。对照的A549和A549/srfres肿瘤比较表明，在40毫克/公斤/天的索拉菲尼治疗的A549/SRFres肿瘤中，E-cadherin水平显著降低，这表明索拉非尼在体内的治疗压力下，A549/SRFres的肿瘤细胞更容易受到EMT的影响。此外，MMP9水平在20 mg/kg/d索拉菲尼和40 mg/kg/d 达沙替尼治疗A549/SRFres的肿瘤中明显低于其亲代，这意味着达沙替尼相对于A549型肿瘤更有效抑制A549/SRFres肿瘤的进展。总之，这些发现表明索拉非尼治疗在A549异种移植中促进EMT，而达沙替尼的存在并不能抑制索拉菲尼诱导的EMT，但可能因增加肿瘤中MMP9和α-SMA表达水平会增加转移潜力。
在体内研究中，在索拉非尼治疗的肿瘤中个体EMT标记的表达水平与对照肿瘤中的个体之间存在差异。例如，在最初的研究中，索拉非尼的治疗导致了β-catenin明显下调和vimentin 适度上调在A549和A549/SRFres肿瘤，但在体内的随后研究表明，在索拉非尼治疗的肿瘤中，与对照肿瘤相比，显示β-catenin几乎没有变化，但明显上调vimentin。这些差异可以部分解释为开始治疗的时间差异(在肿瘤接种后一周和三周)和治疗持续时间(8 ，12周vs 4周)。
评估血浆和肿瘤里的索拉菲尼和达沙替尼稳态浓度
索拉非尼和达沙替尼的浓度在血浆和肿瘤最后剂量4小时后收集，以量化确定减少药物有效性可归因于索拉菲尼耐药肿瘤减少药物分布，和是否存在药物之间的相互作用改变了其他药物在肿瘤分布。如表1所示，在A549和A549/srfres异种移植之间，索拉非尼和达沙替尼的稳态肿瘤浓度没有显著差异。索拉非尼和达沙替尼在最后一次剂量后的4小时内显示了血浆和肿瘤药物浓度的剂量变化，这表明了线性药物动力学。当这两种药物的剂量相同时，达沙替尼的血浆浓度低于索拉非尼的血浆浓度，这表明达沙替尼的半衰期比索拉非尼更短。因此，达沙替尼的肿瘤浓度在4小时内比索拉非尼肿瘤的浓度低约1.7倍，而不考虑肿瘤类型(表1)。

探讨：
尽管人们已经做出了大量的努力来研究在各种类型的癌症中获得索拉非尼耐药机制，但是没有人关注于NSCLC索拉菲尼耐药。在本研究中，采用A549人肺腺癌模型，探讨了获得索拉非尼耐药的潜在机制。在体内，耐药模型比体外模型更有优势，因为它们提供了肿瘤细胞所在的组织微环境。该研究使用的是一种衍生于生长最快的A549型肿瘤中的一种耐药模型，这种模型对索拉非尼在体内的治疗不敏感。与串行体内原发性肿瘤相比,使用索拉菲尼耐药A549亚系通道数较低(< 10)的优势提供可重现认识的耐药生物机制和利于相关识别的过程促进有效的治疗策略克服耐药,但可能遭受原发肿瘤某些遗传特性变化的缺点在体内到体外再到体内转换过程中。一项有趣的观察结果是，尽管人工培养的A549/srfres细胞的倍增时间与A549细胞相似，但与相应的亲代细胞相比，A549/srfres异种移植物的生长速度明显加快。这一发现提出了一种可能性，即先前的选择过程使A549/srfres细胞获得某些性状，使它们能够比A549个亲代细胞更快地适应微环境扩散障碍。尽管在体内观察到不同的肿瘤生长率，我们仍然可以利用这个模型来确定一个新的旁路机制获得索拉非尼的耐药，并评估达沙替尼是否可以作为索拉非尼治疗的一个潜在辅助手段来克服耐药性。
在A549和A549/SRFres异种移植中，对几种EMT标记的表达模式进行了分析，发现在索拉菲尼治疗肿瘤中，与对照组相比，在接受治疗的肿瘤中，有下调E-cadherin表达和上调vimentin的表达倾向。索拉非尼治疗的A549/SRFres型异种移植似乎与索拉非尼治疗的A549型异种移植物在很大程度上相似。EMT的激活常常导致恶性肿瘤侵犯行为，它与肝细胞癌(HCC)模型中的索拉非尼的耐药性有关。在最近的一项研究中，体外培养的索拉菲尼耐药HepG2和Hus7S1细胞株显示出了E-cadherin丢失，并增加了vimentin的表达，伴随着更大的侵犯潜力(van Malenstein et al., 2013) 。在这项研究中，在培养的A549和A549/srfres细胞之间EMT标志物表达没有差异，也没有在他们的迁移和侵袭表型中发现任何差异，这表明肿瘤微环境在诱导EMT中扮演着重要的角色(Jing et al., 2011)。在索拉菲尼治疗的A549和A549/srfres肿瘤中，其明显减少β-catenin的确切机制是不清楚的。尽管如此，据报道，在恶性黑色素瘤的疾病进展中，β-catenin丢失或下调与疾病的进展有关(Kageshita等人，2001年)，而索拉非尼则在人类肝癌细胞系中有效减少了β-catenin水平(Lachenmayer等人，2012年)。因此,我们推测,肿瘤组织匀浆连环蛋白β-catenin水平的减少可能是由于降低了膜和细胞质连环蛋白水平β-catenin水平，而此又是E-cadherin和β-catenin之间相互作用缺失的结果，导致从细胞粘合连接处释放β-catenin(Onder et al., 2008) ，随后β-catenin的核易位导致诱导EMT (Alvarado et al., 2011; Ghahhari and Babashah, 2015)。
在本研究中，除了索拉菲尼治疗的A549/srfres肿瘤中MMP9蛋白表达的明显上调外，我们还观察到在40mg/kg/d索拉非尼治疗的A549和A549/SRFres 升高表达磷酸化AKT (S473)，FAK (Y397)， Src (Y416)，没有统计学意义，很大程度上是由于个体间的差异造成的。尽管如此，我们的体外研究表明，在A549/srfres细胞中，磷酸-src(Y416)和磷酸化FAK (y576/577)的基线水平明显高于A549细胞。考虑到FAK和AKT信号通路的激活，建议在HCC中上调MMP9的表达导致增强细胞侵犯(Cheng et al., 2006; Chen et al., 2010a), 很容易推测AKT，FAK和Src是潜在的可选信号分子被激活来逃避索拉非尼的治疗。据报道，pi3k/akt信号通路的补偿激活为索拉非尼获得性耐药(Chen et al., 2011), 疗协同作用可以通过索拉非尼与PI3K/AKT抑制剂(Chen et al., 2010b;Zhai et al., 2015; Lindblad et al .,2016)。此外，激活了PI3K/AKT通路，下调膜E-cadherin和β-catenin的水平，并促进了肿瘤细胞的入侵(Yip and Seow, 2012), 这表明在索拉非尼治疗的肿瘤中，观察到的E-cadherin和β-catenin的下降，可能是由索拉菲尼诱导的PI3K/AKT通路的激活。到目前为止，尽管索拉菲尼诱导激活FAK和Src尚无记录, FAK和获得性耐索拉非尼之间的可能联系被描述在最近的一项研究中,这表明αvβ3-integrin/FAK / PI3K / AKT信号通路参与galectin-1诱导EMT和索拉非尼在肝癌细胞耐药(Zhang et al .,2016)。FAK和Src是细胞质的非受体酪氨酸激酶对细胞粘附的直接或间接影响作用于其他粘附调节因子(Calautti等人，1998; Noren et al., 2001)。FAK是几个生长因子的下游靶点(Mitra等人，2005年)，而Src是FAK一个重要的调节因子(Mitra等人，2004)。在Y397位点整合素刺激FAK磷酸化，激活FAK-Src复合体，这为Src创造了一个绑定位点。然后，Src将在FAK域激活回路中介导y576/y577的磷酸化，随后激活了p130cas相关的能动性促进信号级联，导致了MMP2和MMP9的诱导和激活，从而促进了癌细胞的侵犯(Van Slambrouck等人，2007年)。
基于我们的初步发现，我们提出了一种可选的生存机制，它可以让KRAS突变的NSCLC通过激活FAK / Src复合体来逃避索拉非尼的治疗。鉴于Src在调节FAK过程中所扮演的重要角色，并推动肿瘤细胞增殖、生存、粘附、运动和侵犯(Bromann等人，2004年; Thomas and Jordan, 2004), 我们接下来研究索拉非尼是否与达沙替尼联合可提高抗肿瘤功效，并延迟索拉非尼获得性耐药。体外研究结果显示，在A549和A549/srfres的3:1, 1:1 和1:3固定摩尔比率中，同时暴露于索拉非尼和达沙替尼，产生最大添加协同细胞毒性效应，这表明索拉非尼和达沙替尼的联合治疗是一个合适治疗方案。在血浆和肿瘤中发现索拉非尼和达沙替尼的浓度，表明索拉非尼和达沙替尼的瘤内浓度大约是3，这是在体外产生协同效应的浓度范围内。与体外数据一致的是，达沙替尼单独或与索拉非尼联合治疗，在A549/srfres肿瘤中产生的肿瘤生长抑制相对于A549肿瘤的肿瘤生长抑制更大。A549/SRFres肿瘤对达沙替尼治疗的增强敏感性可能与A549/SRFres细胞内上调基线FAK - Src活性有关。尽管索拉非尼和达沙替尼的体外协同作用，半剂量索拉非尼-达沙替尼联合治疗的体内抗肿瘤效果低于全剂量索拉非尼治疗，但优于全剂量达沙替尼治疗，而不考虑肿瘤类型。尽管如此，半剂量的索拉非尼沙替尼联合在使用相同剂量时，表现出比单剂索拉非尼或达沙替尼更大的抗肿瘤活性。免疫印迹分析所示,虽然半剂量联合有效地抑制Src和AKT磷酸化,并没有阻止Y576/577-FAK磷酸化，也没有减少vimentin波形蛋白表达,但出人意料地增加了Y397-FAK磷酸化和瘤内MMP9表达,表明抑制Src磷酸化本身是不足以阻碍索拉非尼获得性耐药的EMT激活和侵犯潜力提高。上调Y397-FAK磷酸化可能是由细胞因子、生长因子、整合素等微观环境因素引起(Sulzmaier et al., 2014)。需要进一步的研究来描述肿瘤微环境对src独立的FAK信号传导通路的影响。
总之，研究结果表明，FAK/Src激活不但助于索拉菲尼获得性耐药通过促进EMT和侵犯潜能在KRAS突变的A549型异种移植中，而且说明Src抑制本身不足以克服耐药性。鉴于致癌通路的不断进化的冗余，使肿瘤细胞能够补偿几个靶基因和路径，克服通路靶向药物获得性耐药的主要挑战是确定一个“主开关”，它可以调节和协调与耐药性相关的多个信号通路。尽管如此，这项工作提供了两个靶向治疗药物的合理联合，以对抗肿瘤对单剂靶向治疗的耐药性。根据我们的发现，进一步的研究可以确定最有效的联合治疗，以最大限度地提高索拉非尼在KRAS突变NSCLC中的治疗效果。
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这个药吃有很多注意好像，比较容易出血