非信号通路耐药机制-19S蛋白酶体子单元

Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Jan 10; 114(2):382–387.

Published online 2016 Dec 27. doi:  10.1073/pnas.1619067114

Suppression of 19Sproteasome subunits marks emergence of an altered cell state in diverse cancers

标题：在多个癌症19S蛋白酶体子单元的抑制标志着一个改变的细胞状态出现

（本文意义在于提出非信号通路耐药机制）

(蛋白酶体知识参考

http://baike.sogou.com/v401296.h ... D%E9%85%B6%E4%BD%93)

本文意义：在之前的研究中，我们利用全基因组的筛选，发现了一种违反直觉的机制，通过实验性诱导复合物中调节颗粒的失衡，细胞可以获得对蛋白酶催化核心的抑制剂耐药。不过，在许多情况下，在体外发现的获得耐药性的机制通常不会转化为相应的实际临床癌症。在这里,本文表明,该机制实际上具有自发地和自然地展开在不同的人类癌症系，不仅增加抗蛋白酶体抑制剂在体外和临床耐药,也是一个一个独特的基因信号和药物可靶向缺陷的更广泛的状态改变。

摘要：

利用蛋白酶抑制剂来治疗癌症依赖于改变蛋白质的体内平衡，受到内在和耐药的极大限制。通过分析成千上万的癌症系和肿瘤的数据，我们发现19S蛋白酶体一个或更多子单元表达抑制，显示了内在的蛋白酶抑制剂的耐药性。此外，这种蛋白酶的子单元抑制与骨髓瘤患者的不良预后有关，而蛋白酶抑制剂是骨髓瘤治疗的主要手段。除了对蛋白酶抑制剂的耐药性之外，蛋白酶的子单位抑制还充当了一个全局重塑转录组的前哨。这种重构产生了一种独特的基因特征，并对致凋亡药物ABT-263产生了新的缺陷。这种常见的、自然产生的19S调节复合体的失衡状态，是通过多种机制实现的，包括DNA甲基化，标志着在不同的癌症中出现了一种可遗传和治疗意义的相关状态改变。

引言：

细胞依赖蛋白酶体机械调节蛋白质灭亡和维持体内平衡(1-3)。一旦致癌变换,无数蛋白毒性压力重压蛋白质体内平衡的细胞机制(2、4)。这些压力导致癌细胞大量地依赖于增强蛋白酶体功能(2、5-8)。可以利用这种依赖性使用天然和合成化合物，以精确的效力和选择性, 抑制20S蛋白酶体催化功能(9、10)。事实上，培养液中这些化合物在抑制多种癌细胞生长的过程中是非常有效的。不幸的是，他们的临床治疗效果出奇的有限，通常只观察几种癌症的治疗效果(9，10)。

作为临床化疗药物，蛋白酶抑制剂的作用有限，可以归结为促进内在和获得性耐药的生物过程。例如，细胞培养模型中获得性耐药通常会在20S蛋白酶体的催化亚基中积累突变(11、12)。然而，就临床相关性而言，这些突变尚未在临床样本中被检测到(13)。其他耐药机制包括改变特定的细胞通路，例如NF-κB的结构性激活(14)，伴侣机制的激活(15，16)，或EGFR/JAK1/STAT3信号通路的改变(17)。

为了进一步探索和识别在不同的蛋白酶抑制剂的存在下产生的耐药性的细胞机制，我们小组和其他人最近将全基因组的基因筛选应用到各种细胞模型(18，19)。在所有的模型检查中，实验性降低了其中19S调节复合体众多不同子单元中其一的表达，导致蛋白酶催化核心抑制剂的耐药(18，19)，并可能在多发性骨髓瘤患者中显示出临床相关性(18)。这些数据表明，短暂的、非突变的机制可能在癌细胞抵抗蛋白酶抑制的能力中起关键作用。在这项工作中，我们研究了这种机制是否由不同的癌症来实现。

结果：

在不同的癌细胞中，一个19S蛋白酶体复合体子单元的表达急剧降低。

我们首先利用药物敏感性基因组癌症(GDSC)数据库，对所有基因编码蛋白质子单元，对相关mRNA表达水平进行特征描述(20)。正如预期的那样，在789个癌细胞系中，20S亚单位的平均表达水平与19S子单位的平均表达水平高度相关。然而，在一些细胞系中，特定的19S子单元的表达比其他细胞系子单元的平均表达式要低得多。为了量化GDSC和癌症细胞系百科全书(CCLE)数据集的每个细胞系的这种现象，我们从每个细胞系的每一个19S子单元的平均值中计算出了SD。然后，每个细胞系被分配一个sigma分数，这表明在该细胞系中任何一个19的子单元平均值的最大的偏离。因此，sigma分数3表示一个细胞系其中至少一个19S蛋白酶复合体亚单位的mRNA表达比所有其他细胞系的平均mRNA水平降低了3个SDs。sigma分数2表示降低2个mRNA SDs，以此类推。GDSC数据集中的所有789个细胞系59个癌细胞中，至少一个19S子单元的信使mRNA水平是3或以上SDs(3)。为了便于参考，我们将它们指定为3sigma系。我们还分析了CCLE数据集，其中包含了990细胞系的信使mRNA表达和DNA副本数数据。其中，6.3%是3sigma系，与GDSC数据集相似。为确定这个19 S亚基大的平均偏差可以通过任何21基因表达随机变化进行解释,我们分析GDSC和CCLE数据集21个基因的1000个随机集的3sigma频率。19 S亚基3sigma细胞的频率远高于预期在GDSC和CCLE数据集中(P值分别= 1.1 e-9和4.5 e-12)。

在3sigma细胞系中被抑制的特殊19个亚单位基因存在变化。PSMD5是在GDSC和CCLE细胞行数据集中最常见被抑制的19S蛋白酶子单元。其他经常降低的子单元包括PSMD1、PSMC6、PSMD10、PSMD14和PSMD6。总的来说，在代表广泛的肿瘤类型的细胞系中，19S子单元的信使mRNA表达降低了。

为了研究人类原发性肿瘤切除标本中19S亚单元信使mRNA抑制的频率和模式，我们进一步分析了肿瘤基因组图谱(TCGA)的信使mRNA表达数据。我们研究了来自53种不同癌症类型的8,557个原发性肿瘤的表达谱。在19S蛋白酶体中，至少有一个亚单位存在3sigma降低的肿瘤的频率是4.3%。此外，对TCGA数据的分析显示，在不同组织学类型的肿瘤中有3sigma亚单位的降低，约占某些肿瘤类型的6%，如低级、高级神经胶质瘤、嗜铬细胞瘤和副瘤、急性髓系白血病、肾细胞癌和皮肤黑色素瘤。有趣的是，对于GDSC和CCLE的数据集来说，PSMD5是人类肿瘤切除样本中最普遍被抑制的19S子单元基因。另外在GDSC和CCLE细胞行数据集，其他19S子单元基因通常显示变化，如PSMD10、PSMD1、PSMC6和PSMD6，在肿瘤切除样本中，这些基因也被抑制了。

降低19S中任何一个子单位的表达与对蛋白酶抑制剂的耐药性密切相关。

接下来，我们研究19S子单元表达的自然降低是否与细胞能够耐受蛋白酶抑制的能力有关。我们在GDSC系列中使用了310个细胞系，用于药物敏感数据，并质询我们的计算过的sigma分数是否与两种化学不同的蛋白酶抑制剂，硼替佐米和MG132有关。sigma分数的增加(例如：降低了单个19S子单元的表达)与增加对硼替佐米和MG132的耐药是高度相关的。sigma分数与增加EC50之间的相关性在sigma大约3分达到平衡;sigma分4或5的细胞中，有明显更高的EC50与sigma分数3的细胞相比。

在细胞株的参考组和3sigma细胞系的对照组中，对硼替佐米和MG132的平均EC50进行了比较，结果显示在3sigma 组(P<0.0001)中，明显更高的EC50。对硼替佐米来说，参考组的EC50的平均自然对数是5.68，而3sigma组EC50的平均自然对数是3.56。20S蛋白酶子组表达类似的sigma-分数分析并没有发现与蛋白酶抑制剂EC50的明显相关性，支持了这样一种观点，即蛋白酶抑制剂的不同敏感性是由19S蛋白酶复合体的亚单元表达降低所决定。我们通过观察两组从神经母细胞瘤和卵巢癌中提取的细胞系，对不同组织学来源的恶性肿瘤进行了实验验证，证实了19S子单元抑制对蛋白酶抑制剂敏感性的影响。每个数据集一个细胞系有自然抑制的19S一个子单元(IMR32，OVSAHO)，而另一个没有(Kelly，OVCAR3)(数据集S1)。IMR32神经母细胞瘤和OVSAHO卵母细胞分别有PSMD5和PSMD9子单元表达被抑制。正如预期的那样，带有自然抑制的19S子单元的细胞相对于没有亚单位抑制的同种癌症类型，表现出相对抵抗蛋白质组抑制的能力。

降低19S子单元信使mRNA表达与抑制剂的耐药和对硼替佐米治疗的骨髓瘤患者的不良结果有关。为了确定耐药的子单元抑制机制是否与治疗环境有相关性，我们分析了两种来源的基因表达数据:一种实验室生成的抗蛋白酶抑制(23)和在硼替佐米临床试验中收集的患者肿瘤样本(22)。实验室模型涉及到套细胞淋巴瘤系Jeko-1和一种硼替佐米耐药变异体(JBR细胞)(23)。由这些细胞株形成的小鼠(21)异种移植物的转录档案显示，在由硼替佐米耐药的JBR细胞形成的肿瘤中，PSMD5的mRNA水平有了明显的降低。

至于患者获得的数据，我们在2007年进行的关键2期和3期临床试验中进行了相关的研究，并在复发多发性骨髓瘤(22)的患者中确立了硼替佐米的疗效。从这些试验中可获得用于预处理的骨髓瘤样品的表达分析数据，但没有治疗后样本收集，妨碍了在硼替佐米治疗和复发后出现的骨髓瘤细胞19S子单元水平的分析。引人注目的是，即使是在治疗前获得的样本中，我们发现，在基线水平上降低了19S亚单元表达，与硼替佐米差的疾病控制相关。来自于264名硼替佐米未治疗患者的54个样本显示，至少有一个19S蛋白酶体子单元的表达降低了。在这54个病例中，有34个病人随后接受了硼替佐米。与患有骨髓瘤没有相应19S子单元表达抑制(P=0.004)的患者相比，这34名患者无进展时间明显较短。值得注意的是，硼替佐米治疗的患者降低了19硼替佐米蛋白酶组的表达，在对照组中，没有比地塞米松更有效的治疗方法。对19S亚单元的抑制也没有引起地塞米松治疗效果的明显改变。

蛋白酶体19S子单位抑制标志一种独特的可遗传状态。

为了研究在细胞中发生的19S子单元的抑制改变蛋白酶抑制剂敏感性，是否是对细胞状态大范围改变的一部分，我们在3sigma细胞系中创建了一个株序基因表达改变的列表。对CCLE和GDSC数据集的分析，包含了1000多个细胞系，得出了非常相似的结果。降低了19S子单元表达的细胞与几个关键的致癌和信号通路的基因明显降低有关。例如，上皮间间质转换(EMT)基因信号明显降低，这些细胞也显示与EGF和TNF信号和热休克相关基因相关的基因信号的降低相关。这种高度明显差异基因表达和基因组合富集是令人信服的，特别是考虑到它们来自于许多不同的癌症细胞株。

由于在细胞株中对EMT信号的强烈抑制，我们重点分析了原发性乳腺癌样本的表达谱，这是一种EMT肿瘤类型，在肿瘤进展、侵犯以及最终的全身转移起着至关重要作用(24、25)。我们使用了TCGA的信使mRNA表达数据，并将乳房肿瘤定义为一个控制，除非它们的至少一个19S蛋白酶体子单元有3sigma减少。在蛋白质组3sigma肿瘤中特别富集的基因主要与线粒体氧化磷酸化和核糖体的生物起源有关。这些发现表明，3sigma肿瘤可能经历了一次较不完全的有氧糖酵解(瓦尔堡效应)的转变，因此可能对线粒体呼吸的依赖程度高于控制肿瘤。基因-set富集分析进一步揭示了三sigma癌症的独特特征,这在癌细胞系和原发肿瘤之间是保守的。例如，EMT基因信号在3sigma原发性乳房肿瘤中基本上被抑制。

细胞外基质(ECM)基因在3sigma肿瘤中也被抑制;ECM基因与EMT和EGF信号传递都高度相关。因此，在现有的肿瘤细胞系和原发性肿瘤中，在任何一个19S蛋白酶体子单元中，许多有3sigma减少的其他恶性肿瘤细胞存在相似的生物途径。

自然发生的19S子单元抑制使其对ABT-263抑制产生脆弱性。

我们的数据显示，在19S调节复合体单个子单元的失衡是许多癌症细胞形态大转变的一部分。使用公共的药物筛选数据集，我们思考这种自然发生的，改变的状态是否会改变多种癌症对药物的敏感性，而不仅仅是蛋白酶抑制剂。我们检查了140种药物的敏感性数据，其中大多数是筛选自GDSC数据集的655个细胞系。对于每一种药物，我们计算了3sigma中所有细胞的平均EC50，并将其与对照组的平均EC50进行了比较。如前所述，3sigma细胞系对蛋白酶抑制剂MG132和bortezomib相对较耐药。然而，自然发生的3sigma细胞株对BCL2家族抑制剂ABT-263更敏感; P = 0.0077)。对GDSC数据集中BCL2-家族基因表达水平的分析表明，与对照组相比，3sigma组的BCL2的表达水平相对较(但明显)高于对照组。是否存在一种直接的机制联系，即BCL2的增加表达与19S子单元抑制细胞的抑制剂耐药之间的联系仍有待确定。

我们验证了在先前描述对比的神经母细胞瘤中，3sigma细胞株对ABT-263增加脆弱性。在PSMD5被抑制后，IMR32细胞对ABT-263的敏感度要比Kelly细胞高50到100倍，而Kelly细胞没有子单位抑制。ABT-263靶向BCL2家族的几个成员，包括BCL2和BCL-XL。不过，BCL-XL限制了促凋亡药物的敏感性。IMR32细胞对更特异BCL2抑制剂 (ABT-199), BCL-XL (WEHI 539), 和MCL1 (A-1210477)的敏感性没有增强。这一发现表明，由于对BCL2和BCL-XL的双重靶向，蛋白酶3 sigma细胞对ABT-263的敏感性的原因尚未确定。正如预期的那样，IMR32细胞可以通过强制转基因表达PSMD5子单元而对一种蛋白酶抑制剂重新敏感。然而，这并没有改变他们对ABT-263或其他BCL2家族成员抑制剂的敏感性，这表明在19 S蛋白酶3 sigma细胞中观察到的ABT-263敏感性增加是由于细胞状态的改变，并不一定是由蛋白酶的子单位直接缺失驱动的。

在癌症中降低特定的19种蛋白酶子单位表达的机制。

转录组的重新布线可能是由基因组畸变或后生变化引起的。许多染色体区域在癌症中反复地丢失，其中一些区域有编码19 S蛋白质组子单元基因，如PSMC2(26)。来自CCLE的DNA测序数据使我们能够确定19 S子单元信使mRNA表达的降低是否与拷贝数丢失有关。值得注意的是，在大多数的3 sigma细胞系中，降低19 S子单元的信使mRNA表达与基因拷贝数损失无关。例如，在PSMC3、PSMC4、PSMD5、PSMD7、PSMD8和PSMD10子单元中，3 sigma细胞系没有涉及这些基因的副本数损失。其他19 S子单元3sigma细胞株显示了部分的基因拷贝数损失。因此，除了19S子单元表达降低之外，大多数癌症细胞系主要是由基因拷贝数改变引起。

为了进一步研究，我们检查了PSMD5的调控，因为它是癌细胞和肿瘤中最常被抑制的19 S子单元。基因表达抑制的一种常见机制是其启动子的甲基化。我们评估了PSMD5启动子的甲基化在低级胶质瘤(LGG)和膀胱癌(BLCA) 作用，肿瘤类型中，PSMD5 3 sigma样本甲基化频率最高。在这两种肿瘤类型中，19 S蛋白酶体3 sigma肿瘤显示PSMD5启动子的甲基化程度明显更高，这表明启动子甲基化是抑制肿瘤中PSMD5信使mRNA表达的主要机制。

为了实验验证我们的发现，我们回到了神经母细胞瘤细胞对，IMR32和Kelly。确认CCLE数据,我们定量RT-PCR测量表明, 在两个细胞系之间，所有19 S子单元相关mRNA表达非常相似，除了稍微增加了Kelly细胞的PSMC2 mRNA水平和预期的8倍PSMD5 mRNA降低在IMR32细胞。通过对PSMD5启动子的DNA硫酸盐的转化和测序，我们发现在IMR32细胞中，该启动子的强DNA甲基化，在启动子CpG岛有98%的残留被修改。相反，在Kelly细胞中，PSMD5启动子的甲基化程度最低，CpG岛只有4%胞嘧啶甲基化。尽管这些发现可能令人吃惊，PSMD5是唯一的19S蛋白酶子单元基因，在CCLE数据集中显示了表达的抑制和启动子DNA甲基化之间有很强的相关性。因此，我们认为有多种途径实现其他19S子单元的抑制。这些可能包括基因和表观遗传机制，因为它们与肿瘤生物学有明显的相关性，这将是未来研究的重要领域。

探讨：

调节蛋白酶子组信使mRNA表达的转录程序是高度协调的，以维持多种蛋白质组组分的化学计量平衡，并促进26S蛋白质组复合体的有效组装(27 29)。然而，蛋白酶体复合体装配的一个重要变化可能是仅仅一个子单元的表达水平改变的结果(26，30 33)。通过对数千种癌症的研究，我们发现，构成19S调控复合体的子单元通过各种机制出现表达失衡。在PSMD5子单元的情况下，多个癌症显示了由启动子DNA甲基化所介导的抑制。然而，其他子单元并没有使用这种机制。事实上，其他的实验室已经表明，有几种类型的癌症显示了染色体丢失的区域，这些区域包括了PSMC2子单元编码的位点。这一删除有两方面的影响:一是所有26S蛋白质组水平下降，二是在26S到20S之间的比例下降(26)。此外，PSMC2降低表达与多发性骨髓瘤患者对卡菲佐米治疗(18)的不良反应有关。因此，DNA甲基化和基因拷贝数的改变明显地涉及到在多种癌症中调节19个子单位的表达。其他的机制，包括组蛋白的修改、新的突变和微RNA，也可能被利用。不管抑制机制,然而,组成19S复合体的许多子单元任何一个单元的降低，在很大程度上反映了改变的细胞状态的特征是增加抗蛋白酶体抑制剂耐药,改变基因表达信号,并增加对BCL2家族抑制剂ABT-263敏感度和小部分其他临床相关的药物。例如，TNF-NFκB信号通路在细胞中被抑制，这些细胞表现出至少一个19S蛋白酶体子单元的表达抑制。这种下降的规律与观察到蛋白酶抑制剂对NFκB激活(34)有很强的抑制作用的观察一致。此外，TNF/NF-κB通路调节特定的蛋白质组子单元的转录(包括PSMD5)(35)。然而，在3sigma组中观察到的最明显的差异，是与EMT过程相关的基因的表达改变。显示单个19个子单元的细胞系被抑制的细胞株增加了上皮的特征，这表明其侵入性较低，间质性较低。引人注目的是，在KRAS突变细胞系中，增强的上皮基因特征与增强对ABT-263 (36)的敏感性相关，这与我们在这里的发现一致。此外,分析原发性乳腺癌显示3sigma肿瘤显示减少有氧糖酵解和更高依赖氧化磷酸化/线粒体呼吸。在功能层面上，我们试图推测，对ABT-263的超敏性，我们发现它与19S子单元表达失衡有关，与我们的基因集浓缩分析所暗示的线粒体生理学的改变有关。

我们的研究结果表明，某些肿瘤，或者同样重要的是，在一个不同的肿瘤细胞中存在着一些改变的癌细胞，在这个细胞状态中，19S子单元的表达是失衡的。这个状态似乎是一个更大的细胞计划的一部分，它超出了蛋白酶的功能调节，包括新陈代谢和信号传导。此外，虽然在促增殖的唯一背景下，以调节子单元失衡为特征的更上皮、更有分化的状态是不利因素，但在整个肿瘤中，它很可能作为一种包赢机制，以增强细胞的生存，蛋白质体内平衡尤其受到挑战。在恶性进展的过程中，设计出针对肿瘤细胞和其他各种表观遗传和表型状态的正交策略，可能会限制对化疗药物的适应，阻止耐药性克隆的出现，并增强我们消灭晚期癌症的能力。

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